滅活劑是指能致死細(xì)菌或病毒，使其失去復(fù)制能力或致病力（毒力）的化學(xué)物質(zhì)。凍干保護(hù)劑是指冷凍真空干燥的生物制品中抗原活性物質(zhì)以外的添加物。滅活和凍干對(duì)生物制品的抗原含量、核酸含量、免疫原性、穩(wěn)定性和保存期影響較大。不同滅活和凍干技術(shù)的原理并不同，需根據(jù)微生物類型和制備目的，針對(duì)性選擇適用的滅活劑和凍干劑。
生物制品意義上的滅活是指利用物理或化學(xué)方法，破壞微生物生物學(xué)活性，使其喪失繁殖能力和致病能力，但仍然保留反應(yīng)原性和免疫原性的過(guò)程。目前多用化學(xué)方法進(jìn)行微生物的滅活，用來(lái)滅活的化學(xué)試劑或藥物等稱為滅活劑( inactivator ) 。使用化學(xué)滅活劑進(jìn)行滅活是制備滅活疫苗最重要的手段，化學(xué)滅活劑的滅活效能與使用劑量、滅活時(shí)間、滅活時(shí)的溫度及溶液的pH等都與滅活疫苗的質(zhì)量密切相關(guān)。 β-丙內(nèi)酯（BPL）對(duì)病毒有較強(qiáng)的滅活作用，其作用機(jī)制不是直接作用于殼蛋白，而是通過(guò)改變微生物核酸結(jié)構(gòu)達(dá)到滅活的目的。大劑量BPL是一種潛在的致癌物，但其極易水解。BPL滅活周期短，經(jīng)濟(jì)效益高，但相較甲醛價(jià)格較高；對(duì)病毒有較強(qiáng)的殺滅作用，低質(zhì)量濃度的BPL（2~4mg/L）可以破壞病毒核酸，但不改變病毒蛋白質(zhì)。試驗(yàn)結(jié)果顯示：BPL對(duì)禽流感病毒的最佳滅活條件為1：3000滅活24h，或1：1000滅活18h；對(duì)H9N2亞型AIV滅活能力強(qiáng)，對(duì)血凝素影響小，易水解成無(wú)害無(wú)殘留產(chǎn)物；分別以BPL、甲醛為滅活劑制備H9N2亞型AIV滅活疫苗，免疫SPF雞和廣西土雞，其免疫效果接近。 甲醛是最古典和應(yīng)用最廣的滅活劑。早在1911年，Lowenstein和Eisler就開(kāi)始用甲醛處理破傷風(fēng)毒素。1924年，Puntoni以0.1%甲醛制成犬瘟熱疫苗。甲醛為無(wú)色氣體，易溶于水和乙醇，水溶液稱為福爾馬林，通常濃度為36%-40%，有強(qiáng)烈的刺激性。長(zhǎng)期低溫或受凍保存，可以聚合而成三聚甲醛或多聚甲醛。 甲醛對(duì)微生物核酸和蛋白都有破壞作用。甲醛可與核酸中腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶等含氨基堿基結(jié)合，使微生物核酸變性；與微生物蛋白的氨基結(jié)合形成羥甲基衍生物或二羥甲基衍生物，后者與酰胺交聯(lián)，使微生物蛋白變性，從而阻止其核酸逸出。甲醛滅活微生物也存在一些缺點(diǎn)：作用于病毒殼蛋白時(shí)，容易與酰胺交聯(lián)形成屏障而使作用于核酸的效率下降，導(dǎo)致滅活周期較長(zhǎng)；滅活效果容易受到溫度、pH、微生物種類、濃度的影響；具有致癌性，會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生刺激反應(yīng)。甲醛對(duì)單鏈核酸最有效，因此常被用來(lái)滅活RNA病毒。適當(dāng)濃度的甲醛可使被滅活微生物的抗原性和血凝性保持不變。根據(jù)AIV滅活試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)用0.1%的甲醛滅活A(yù)IV16h后，病毒全部死亡，18h為最佳滅活時(shí)間。 烷化劑（alkylating agent）是含有烷基的分子中去掉一個(gè)氫原子基團(tuán)的化合物，它能與另一種化合物作用，將烷基引入，形成烷基取代物。這類化合物的化學(xué)性質(zhì)活潑，其滅活機(jī)制主要在于烷化DNA分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤等，引起單鏈斷裂或雙螺旋鏈交聯(lián)，妨礙RNA的合成，從而抑制細(xì)胞的有絲分裂。也可與酶系統(tǒng)和核蛋白起作用而干擾核酸的代謝。 烷化劑主要包括二乙烯亞胺（BEI）、乙?；蚁﹣啺罚ˋEI），是常用滅活劑，化學(xué)性質(zhì)活潑。烷化劑可以與蛋白質(zhì)相互作用，破壞蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)，使病毒完全喪失傳染性，但不損傷表面結(jié)構(gòu)蛋白，從而保留其抗原性，因此是制備滅活病毒疫苗的良好滅活劑。目前，用BEI滅活制備的疫苗已使用于動(dòng)物中，尚未在動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)BEI殘留。烷化劑作為滅活劑，對(duì)生產(chǎn)成本、保存條件要求較高，對(duì)細(xì)菌滅活效果一般。 在食品、藥品以及生物體的冷凍干燥和儲(chǔ)藏過(guò)程中，很多因素（如化學(xué)成分、凍結(jié)速率、凍結(jié)和脫水應(yīng)力、玻璃化轉(zhuǎn)變溫度、干燥固體中剩余水分、儲(chǔ)藏環(huán)境的溫度和濕度等）都會(huì)影響其中活性組分的穩(wěn)定性，甚至?xí)?dǎo)致失活。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，除了一些食品、人血漿、牛奶等少數(shù)物料可以直接冷凍干燥外，大多數(shù)的藥品和生物制品，都需要添加合適的冷凍干燥保護(hù)劑和添加劑，配制成混合液后，才能進(jìn)行有效的冷凍干燥和儲(chǔ)藏。按保護(hù)劑功能和性質(zhì)分類可分為：凍干保護(hù)。即在凍結(jié)和干燥過(guò)程中，可以防止活性組分發(fā)生變性的物質(zhì)；填充劑。能防止有效組分隨水蒸汽一起升華逸散，并使有效組分成形的物質(zhì)；抗氧化劑。用作防止生物制品在冷凍干燥過(guò)程以及儲(chǔ)藏過(guò)程中發(fā)生氧化變質(zhì)的物質(zhì)；酸堿調(diào)整劑。在冷凍干燥過(guò)程和儲(chǔ)藏過(guò)程中，能將生物制品的pH調(diào)整到活性物質(zhì)的最穩(wěn)定區(qū)域的物質(zhì)。 凍干保護(hù)劑的主要作用機(jī)制：將病毒凍結(jié)，使其中冰晶升華，從而達(dá)到低溫脫水，防止活性物質(zhì)流失結(jié)構(gòu)水的目的，以降低對(duì)生物活性的影響；降低胞內(nèi)外滲透壓差，維持細(xì)胞活力；保護(hù)或提供病毒恢復(fù)所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，使活性物質(zhì)自我修復(fù)。在選擇凍干保護(hù)劑時(shí)，要考慮保護(hù)核衣殼結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)構(gòu)和核酸穩(wěn)定性。常用的凍干保護(hù)劑有糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)和大分子明膠等。碳水化合物和蛋白質(zhì)是生物制品相關(guān)研究中最為常見(jiàn)的兩種保護(hù)劑。對(duì)多品種生物制品分析發(fā)現(xiàn)，因微生物（或抗原蛋白）結(jié)構(gòu)特點(diǎn)各不相同，適用于它的凍干保護(hù)技術(shù)也不同，所以沒(méi)有一種通用于各種生物制品的“萬(wàn)能”保護(hù)劑。 糖類在微生物凍干過(guò)程中的保護(hù)作用機(jī)制有兩種假說(shuō)：一是糖類的羥基在干燥和脫水過(guò)程中與蛋白質(zhì)的極性基團(tuán)形成氫鍵，進(jìn)而取代蛋白質(zhì)上的水分子，形成一層水化膜，防止氫鍵暴露，從而穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，維持病毒的抗原性；二是含糖溶液在凍干過(guò)程中會(huì)玻璃化，而糖類所處的狀態(tài)為玻璃態(tài)。在玻璃態(tài)下，糖類保護(hù)劑黏度較高，分子擴(kuò)散系數(shù)較低，因而會(huì)將蛋白質(zhì)分子包裹，形成一種碳水化合物玻璃體，從而維持了蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，起到保護(hù)作用。 研究表明：?jiǎn)翁侵校肴樘堑谋Ｗo(hù)效果最佳；二糖的保護(hù)效果普遍較好；三糖中的棉子糖對(duì)細(xì)菌的保護(hù)作用最好。另外，海藻糖和蔗糖用作保護(hù)劑時(shí)效果最好，當(dāng)使用50g/L的海藻糖時(shí)，菌群存活率達(dá)到83%左右，當(dāng)使用100g/L的蔗糖時(shí)，存活率達(dá)到75%左右。此外，海藻糖分子較小，能填補(bǔ)蛋白質(zhì)分子的空隙，有效限制蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化，從而起到保護(hù)病毒蛋白外殼的作用。 在冷凍過(guò)程中，低濃度的甘氨酸可以抑制由于磷酸緩沖鹽結(jié)晶所致的pH變化，并防止蛋白質(zhì)變性。結(jié)晶型甘氨酸的主要作用是提升凍干品的塌陷溫度，防止破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。常見(jiàn)氨基酸保護(hù)劑主要包括精氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸鈉、色氨酸、酪氨酸。研究發(fā)現(xiàn)，2%谷氨酸鈉、2%L-精氨酸鹽酸鹽、2%D-山梨醇、7.6% 酶解酪蛋白、1%海藻糖、4%明膠、15.2%蔗糖、2%牛血清白蛋白的配方，可使豬偽狂犬病病毒凍干保護(hù)率達(dá)到80.40%。 蛋白質(zhì)保護(hù)劑主要包括脫脂乳、血清白蛋白、大豆蛋白、膠原蛋白，其能夠阻止病毒蛋白質(zhì)表面吸附，從而對(duì)凍干過(guò)程中多數(shù)蛋白都能起到保護(hù)作用。此外，蛋白質(zhì)可以在微生物細(xì)胞外形成保護(hù)，在冷凍干燥過(guò)程中，蛋白質(zhì)溶液中的保護(hù)劑與蛋白質(zhì)分子之間相互作用，增加冷凍混合物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，大大增加微生物蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。采用質(zhì)量濃度為10.49%脫脂乳與4.22%葡萄糖混合后凍干副干酪乳酸菌，當(dāng)凍干厚度為0.3cm時(shí)，菌體細(xì)胞存活率最高，達(dá)到94.90%。 滅活和凍干是獸醫(yī)生物制品生產(chǎn)中必不可少的技術(shù)之一。目前，我國(guó)大部分生物制品主要使用甲醛滅活。該方法技術(shù)成熟，價(jià)格低廉，但使用甲醛作滅活劑存在破壞免疫原性、有致癌風(fēng)險(xiǎn)、滅活時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題，難以適應(yīng)新型疫苗發(fā)展。雖然 新型滅活劑研究也已逐步開(kāi)展，但大多仍局限于實(shí)驗(yàn)室研究階段。凍干工藝技術(shù)直接影響生物制品的保存、運(yùn)輸和使用。由于不同保護(hù)劑的保護(hù)機(jī)制各不相同，單一保護(hù)劑不能滿足微生物抵抗惡劣環(huán)境的需求，因此在凍干過(guò)程中常采用不同類型的保護(hù)劑，按照合適的濃度配比進(jìn)行協(xié)同保護(hù)，從而強(qiáng)化保護(hù)效果，保證微生物存活率最大化。
