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Product details

禽流感病毒H9亞型熒光RT-PCR 檢測試劑盒

檢測方法:熒光RT-PCR

產(chǎn)品規(guī)格:50T

保存條件:-20℃±5℃,避光保存

有效期:12個月


  • 產(chǎn)品介紹

    【產(chǎn)品名稱】禽流感病毒H9亞型熒光RT-PCR 檢測試劑盒(熒光RT-PCR法) 


    【包裝規(guī)格】50T/盒


    【預(yù)期用途】

    本試劑盒適用于檢測的扁桃體、淋巴結(jié)等組織病變部與健康部交界處組織、全血標(biāo)本中禽流感病毒H9亞型RNA,適用于禽流感病毒H9亞型感染的輔助診斷。


    【檢驗原理】

    本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術(shù),通過設(shè)計一對禽禽流感病毒H9亞型異性引物,結(jié)合一條特異性探針,用熒光PCR技術(shù)禽流感病毒H9亞型的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測,用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。


    【試劑組成】

    名      稱

      規(guī)      格

    酶液

    50μL×1管

    AIV-H9反應(yīng)液

    1100μL×1管

    AIV-H9陽性質(zhì)控品

    200μL×1管

    陰性質(zhì)控品

    200μL×1管

    備注:不同批號的試劑盒組分不宜交叉使用。


    【儲存條件及有效期】

    -20℃±5℃,避光保存、運輸、反復(fù)凍融≤5次,有效期12個月。


    【適用儀器】

    ABI系列 、安捷倫MX3000P/3005P、Bio-Rad等系列熒光定量PCR檢測儀。


    【標(biāo)本采集】

    病死或撲殺動物,取分泌物、血液、脾臟、扁桃體、腎臟和淋巴結(jié)等


    【保存和運輸】

    上述標(biāo)本短期內(nèi)可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過6個月,標(biāo)本運送應(yīng)采用2~8℃冰袋運輸,嚴(yán)禁反復(fù)凍融。


    使用方法

    1. 樣品處理(樣本處理區(qū))

    1.1 樣本前處理

    組織樣品:每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g,手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨,加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨,待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中,8000rpm離心2min,取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中;全血樣本:待血凝固后,取血清100μL于1.5mL滅菌離心管中。

    1.2 核酸提取

    按照相應(yīng)RNA核酸提取試劑盒進(jìn)行核酸提取,核酸提取產(chǎn)物-20保存。

    2. 試劑配制(試劑準(zhǔn)備區(qū))

    根據(jù)待檢測樣本總數(shù),設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照,每個測試反應(yīng)體系配制如下表: 

    試劑

    AIV-H9反應(yīng)液

    酶液

    用量(樣本數(shù)為N)

    19μL

    1μL

    3. 加樣(樣本處理區(qū)

    將步驟1提取的RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取5μL,分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。

    4. PCR擴(kuò)增(核酸擴(kuò)增區(qū))

    4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi);

    4.2 設(shè)置好通道、樣品信息,反應(yīng)體系設(shè)置25μL;

    熒光通道選擇: 檢測通道選擇FAM, 淬滅通道選擇NONE,參比熒光選NONE。

    4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置:

    步驟

    循環(huán)數(shù)

    溫度

    時間

    收集熒光信號

    1

    1 cycle

    50℃

    15min

    2

    1 cycle

    95℃

    3min

    3

    40 cycles

    94℃

    15sec

    55℃

    30sec

    5. 結(jié)果分析判定

    5.1 結(jié)果分析條件設(shè)定

    5.2 設(shè)置BaselineThreshold一般直接按機(jī)器自動分析的結(jié)果分析,當(dāng)曲線出現(xiàn)整體傾斜時,根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baselinestart值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié)),以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結(jié)果。

    5.3 結(jié)果判斷

    陽性:檢測通道Ct值≤35.0,且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

    可疑:檢測通道Ct值>35.0,且出現(xiàn)典型擴(kuò)增曲線的樣本建議重復(fù)試驗,重復(fù)試驗結(jié)果出現(xiàn)Ct值≤35.0和典型擴(kuò)增曲線者為陽性,否則為陰性。

    陰性:樣本檢測結(jié)果無Ct值且無明顯的擴(kuò)增曲線。

    6. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

    陰性質(zhì)控品:無明顯擴(kuò)增曲線或無Ct值顯示;

    陽性質(zhì)控品:擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)生長期,且Ct值≤30;

    以上條件應(yīng)同時滿足,否則實驗視為無效。

    7. 檢測方法的局限性

    樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān);

    樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現(xiàn)假陽性結(jié)果;

    陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏,會導(dǎo)致假陽性結(jié)果;

    病原體在流行過程中基因突變、重組,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

    不同的提取方法存在提取效率差異,會導(dǎo)致假陰性結(jié)果;

    試劑運輸,保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降,出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果;

    本檢測結(jié)果僅供參考,如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。


    【注意事項】

    ? 所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行;

    ? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化,完全混勻并短暫離心;

    ? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存;

    ? 反應(yīng)中管蓋需蓋緊;

    ? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服;

    ? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行,以免交叉污染;

    ? 實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;

    ? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待,并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。


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