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【產(chǎn)品名稱】日本腦炎病毒熒光RT-PCR 檢測試劑盒(熒光RT-PCR法)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于檢測的扁桃體、淋巴結(jié)等組織病變部與健康部交界處組織、全血等標本中日本腦炎病毒RNA，適用于日本腦炎病毒感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術(shù)，通過設(shè)計一對禽日本腦炎病毒特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光PCR技術(shù)對日本腦炎病毒的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

備注：不同批號的試劑盒組分不宜交叉使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融≤5次，有效期12個月。

【適用儀器】

ABI系列 、安捷倫MX3000P/3005P、Bio-Rad等系列熒光定量PCR檢測儀。

【標本采集】

病死或撲殺動物，取分泌物、血液、脾臟、扁桃體、腎臟和淋巴結(jié)等

【保存和運輸】

上述標本短期內(nèi)可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月，標本運送應(yīng)采用2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復(fù)凍融。

【使用方法】

1. 樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g，手術(shù)剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中；全血樣本：待血凝固后，取血清100μL于1.5mL滅菌離心管中。

1.2核酸提取

按照相應(yīng)RNA核酸提取試劑盒進行核酸提取，核酸提取產(chǎn)物-20℃保存。

2. 試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照，每個測試反應(yīng)體系配制如下表： 

3. 加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟1提取的RNA、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4. PCR擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1 將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量PCR儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2 設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道選擇FAM， 淬滅通道選擇NONE，參比熒光選NONE。

4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

5. 結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設(shè)定

5.2設(shè)置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結(jié)果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內(nèi)調(diào)節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內(nèi)調(diào)節(jié))，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結(jié)果。

5.3結(jié)果判斷

陽性：檢測通道Ct值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。

可疑：檢測通道Ct值>35.0，且出現(xiàn)典型擴增曲線的樣本建議重復(fù)試驗，重復(fù)試驗結(jié)果出現(xiàn)Ct值≤35.0和典型擴增曲線者為陽性，否則為陰性。

陰性：樣本檢測結(jié)果無Ct值且無明顯的擴增曲線。

6. 質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：無明顯擴增曲線或無Ct值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且Ct值≤30；

以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

7. 檢測方法的局限性

? 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

? 陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

? 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；

? 本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

? 所有操作嚴格按照說明書進行；

? 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，完全混勻并短暫離心；

? 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

? 反應(yīng)中管蓋需蓋緊；

? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

? 實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

? 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進行處理。