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【獸藥名稱】非洲豬瘟病毒熒光PCR檢測(cè)試劑盒

【主要成分與含量】

【作用與用途】用于豬全血、血清、脾臟、淋巴結(jié)、肌肉等組織樣品及糞便樣品中非洲豬瘟病毒DNA的檢測(cè)。

【用法與判定】

1  用法

1.1  樣品采集、保存及運(yùn)輸

1.1.1  樣品采集

1.1.1.1  活豬樣品  無菌采集EDTA抗凝血，或采血后按常規(guī)方法分離血清。

1.1.1.2  病死豬或屠宰豬樣品  無菌采集脾臟、淋巴結(jié)、肌肉等組織樣品。

1.1.1.3  病豬所處環(huán)境樣品  采集糞便樣品。

1.1.2  樣品保存  所有待檢樣品在2～8℃保存應(yīng)不超過24小時(shí)；在-20℃保存應(yīng)不超過6個(gè)月；長期保存時(shí)，以-70℃以下為宜。

1.1.3  樣品運(yùn)輸  樣品一定要放置在有干冰或冰塊的冷藏包中，保持全程冷鏈運(yùn)輸。要求在運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室時(shí)，干冰仍覆蓋標(biāo)本或冰塊仍未完全融化。

1.2  樣品處理

1.2.1  抗凝血和血清處理  取抗凝血或血清200μl，置1.5ml滅菌離心管中。

1.2.2  組織樣品處理  分別從待檢組織三個(gè)不同的部位稱取樣品約1g，用手術(shù)剪剪碎混勻，再取0.05g于研磨器中研磨，加入1.5ml生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5ml滅菌離心管中，8000r/min離心2分鐘，取上清液200μl，置1.5ml滅菌離心管中。

1.2.3  糞便樣品處理  取0.3g樣品于研磨器中研磨，加入1.5ml生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至1.5ml滅菌離心管中，8000r/min離心2分鐘，取上清液200μl，置1.5ml滅菌離心管中。

1.2.4  陽性對(duì)照處理  取陽性對(duì)照200μl，置1.5ml滅菌離心管中。

1.2.5  陰性對(duì)照處理  取陰性對(duì)照200μl，置1.5ml滅菌離心管中。

1.3  病毒DNA的提取

1.3.1  取已處理的樣品、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，分別加入200μl消化液和20μl蛋白酶K，振蕩混勻后，置56℃水浴中消化，每5分鐘渦旋振蕩一次，共消化15分鐘。

1.3.2  從水浴鍋中取出樣品管，降至室溫后，加入200μl DNA結(jié)合液，顛倒混勻，將全部液體移入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時(shí)盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時(shí)堵塞吸附柱），室溫靜置3分鐘，10000r/min離心30秒。

1.3.3  棄去收集管中液體，加入500μl DNA洗滌液，10000r/min離心30秒。

1.3.4  重復(fù)步驟1.3.3。

1.3.5  棄去收集管中液體，10000r/min空柱離心1分鐘，以除去殘留的DNA洗滌液。

1.3.6  將吸附柱放入新的1.5ml離心管中，向柱中央加入DNA洗脫液50μl，室溫放置2分鐘，10000r/min離心30秒，離心管中液體即為模板DNA。

1.4  實(shí)時(shí)熒光PCR操作

1.4.1  反應(yīng)體系配制  設(shè)被檢樣品、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照的份數(shù)總和為N，按如下反應(yīng)體系配制：  

        將以上配制的反應(yīng)體系充分混勻后，分裝至每個(gè)反應(yīng)管中各19μl。分別取1.3.6中DNA 1μl，加入相應(yīng)反應(yīng)管中，蓋緊管蓋后5000r/min離心30秒。

1.4.2  擴(kuò)增  將反應(yīng)管放入熒光PCR儀內(nèi)，記錄樣本擺放順序。反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性2分鐘；95℃變性5秒，58℃退火延伸15秒，共40個(gè)循環(huán)，熒光收集設(shè)置在每次循環(huán)的退火延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行（報(bào)告基團(tuán)“FAM”，淬滅基團(tuán)“NONE”）。

2  判定

2.1  結(jié)果分析條件設(shè)定  閾值設(shè)定原則：閾值線超過陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，且相交于陽性對(duì)照擴(kuò)增曲線進(jìn)入指數(shù)增長期的拐點(diǎn)，或根據(jù)儀器噪聲情況進(jìn)行調(diào)整。每個(gè)樣品反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)即為Ct值。

2.2  結(jié)果成立條件  陽性對(duì)照Ct值＜30并出現(xiàn)特異的擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無Ct值且無特異的擴(kuò)增曲線，試驗(yàn)結(jié)果成立。

2.3  結(jié)果判定

2.3.1  被檢樣品Ct值≤35并出現(xiàn)特異的擴(kuò)增曲線，判為非洲豬瘟病毒核酸陽性。

2.3.2  被檢樣品無Ct值或Ct值≥40且無特異的擴(kuò)增曲線，判為非洲豬瘟病毒核酸陰性。

2.3.3  被檢樣品35＜Ct值＜40并出現(xiàn)特異的擴(kuò)增曲線，判為非洲豬瘟病毒核酸疑似，對(duì)疑似樣品，需重新取樣提取DNA，按雙倍模板量（即2μl DNA）進(jìn)行復(fù)檢，Ct值＜40并出現(xiàn)特異的擴(kuò)增曲線判為陽性，否則判為陰性。

【注意事項(xiàng)】  

（1）所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度下保存。

（2）實(shí)驗(yàn)室應(yīng)分配液區(qū)、模板提取區(qū)和擴(kuò)增區(qū)。工作流程順序?yàn)榕湟簠^(qū)→模板提取區(qū)→擴(kuò)增區(qū)。各區(qū)器材試劑專用，不可跨區(qū)使用。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后立即用1%次氯酸鈉或75%酒精或紫外燈消毒工作臺(tái)。

（3）PCR擴(kuò)增反應(yīng)液應(yīng)置于冰盒上使用，其余冷凍保存的試劑使用前應(yīng)室溫融化，再8000r/min離心15秒，使液體全部沉于管底。用畢所有試劑立即放回原處。

（4）離心管、吸頭等在實(shí)驗(yàn)前應(yīng)全部高壓滅菌。用滅菌的鑷子夾取離心管，打開和蓋上離心管蓋時(shí)避免手和手套接觸離心管口，若離心管開蓋時(shí)有液體粘在手上或?yàn)R出，應(yīng)立即更換手套。

（5）提取的樣品，短期內(nèi)使用放置于2～8℃或冰上，長期應(yīng)在-70℃以下保存，但仍以新鮮提取的樣品效果最好。

（6）反應(yīng)體系在特定配液區(qū)配制，配制和分裝反應(yīng)體系時(shí)應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡，上機(jī)前，5000r/min離心30秒，檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)嚴(yán)格控制污染。

（7）嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得最好的結(jié)果。操作過程中移液、定時(shí)、轉(zhuǎn)速等全部參數(shù)必須精確。

（8）注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，不同批次試劑盒之間的組分不要混用。

（9）所有用于檢測(cè)的廢棄物品均應(yīng)放入含消毒液的廢物缸內(nèi)，高壓滅菌處理。

【規(guī)格】50份/盒

【批準(zhǔn)文號(hào)】獸藥生字191538869